希佩尔-林说念详细征（VHLS）是一种遗传性癌症详细征，临床发扬为核心神经系统血管母细胞瘤、透明细胞肾癌、嗜铬细胞瘤、视网膜血管瘤过甚他多种症状。该疾病由VHL基因突变激励，呈常染色体显性遗传。可是部分VHLS病例为新发突变indian sex5，其中少量数患者发扬为嵌合型。嵌合型患者的基因检测由于血液DNA中突变等位基因的低拷贝数而容易出现假阴性损失。本文报说念一例 39 岁患者通过多种方法进行VHLS分子遗传学诊断的案例，包括对非同步原发肿瘤进行突变分析、选定高阴私深度NGS本事对血液DNA进行重复检测等。最终该患者被诊断为嵌合型VHLS，其血液DNA中c.481C>T（p.Arg161Ter）变异品貌为 2%。本文还总结了对于嵌合型VHLS的文件数据：包括临床发扬的严重进程、通例VHL基因检测阴性时的辩认诊断重心，以及突变佩带者需选定的迥殊主动监测与治愈有缱绻。
背 景
希佩尔-林说念详细征（VHLS）是一种遗传性癌症详细征。其临床发扬为透明细胞肾癌（CCRC）及核心神经系统血管母细胞瘤（最常见发扬）；约三分之一的患者会发展为嗜铬细胞瘤。视网膜血管瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、附睾及子宫阔韧带囊腺瘤、内淋巴囊肿瘤在VHLS中较罕有。非肿瘤性临床发扬包括肾囊肿和胰腺囊肿。VHLS由位于3p的VHL肿瘤抑遏基因的胚系突变引起，根据Knudson二次打击模子，该基因在肿瘤中失活：一个等位基因佩带胚系“功能丧失”突变，而另一个等位基因在肿瘤细胞中因体细胞点突变、大片断缺失（“杂合性缺失”）或启动子甲基化发生蜕变。该详细征以常染色体显性形势遗传，具有高外显率。既往文件报说念的VHLS更生儿发病率范围为 1:27，000-91，000，典型揣度值约为 1:36，000；可是，2023 年 11 月基于gnomAD v2.1.1数据库狡计的高加索东说念主群中致病性变异佩带者的频率为 1:4.4-8.9，000 例，标明当年对VHLS发病率存在低估。根据流行病学揣度，VHLS可能占CCRC病例的 5%，尤其在年青患者中。CCRC的平均发病年岁为 40-45 岁，VHLS患者毕生患病风险约为 70%。合适VHLS诊断范例的患者需进行分子遗传学检测。领先通过多基因panel进行下一代测序（NGS）或Sanger测序分析VHL基因编码区及经典剪接位点的点突变。若损失为阴性，第二步需选定如MLPA（多重连气儿依赖性探针扩增）本事检测VHL基因区域的大片断缺失。分子遗传学检测的临床样本为全血。VHLS患者平素佩带一个突变等位基因和一个正常等位基因；某些低活性VHL等位基因的复合杂合或纯合患者会出现与VHLS表型无关的遗传性红细胞增多症。
张开剩余87%可是，这一保举诊断经过对嵌合型变异的检测奢睿度较低。举例，已报说念一例 55 岁男性病例，其因左肾原发CCRC伴肺转换及右肾上腺嗜铬细胞瘤住院。查验还发现肝、骨转换及脊髓内两处血管母细胞瘤。通过包含VHL在内的NGS panel检测对患者血液DNA进行点突变及拷贝数变异（CNV）分析，未发现致病性、可能致病性或临床好奇景仰好奇景仰好奇景仰好奇景仰未明变异（VUS）。但对其原发肿瘤及转换灶进行DNA测序骄傲，扫数样本均佩带VHL基因3好外显子的可能致病性错义突变c.593T>C（p.Leu198Pro），突变品貌为 10-55%，这在来自不同器官、不同类型原发肿瘤的体细胞突变中极为荒废。再行分析胚系NGS数据发现，该变异在血液中突变品貌为 6%，但由于NGS数据处理时将最小等位基因频率（MAF）阈值设为 10%（胚系变异筛查中过滤测序诞妄[sequencing artifacts]的通例操作），该变异被过滤。肿瘤中佩带VHL突变的细胞比例高于血液，且存在第二个VHL等位基因的缺失，因此扫数检测样本均检出该突变。本案牍例标明，若范例诊断经过未能明确合适VHLS临床范例的患者的病因，不应隔断突变筛查。本文报说念一例血管母细胞瘤合并CCRC的嵌合型VHLS患者。其通过Sanger测序及MLPA两次分子遗传学检测均呈阴性，导致无法保举靶向治愈。肿瘤分析发现重复出现的致病变异，选定高阴私深度NGS检测骄傲血液中突变品貌仅为 2%，最终通过践诺室方法确诊VHLS。
患者细则
患者男，39 岁，2024 年因希佩尔-林说念详细征（VHLS）相关问题至俄罗斯医学遗传学讨论中心经受遗传商量及分子遗传学诊断。患者无肿瘤家眷史。12 岁时初度发现血管母细胞瘤并行左眼球摘除术及假体植入术。2010 年对第 4 颈椎（3.3 cm³）收用 9 胸椎（2.8 cm³）区域血管母细胞瘤行立体定向大分割辐射治愈。2010 年第三方践诺室选定Sanger测序及MLPA本事进行分子遗传学分析，未检出VHL突变。2013 年行延髓及小脑基底部血管母细胞瘤辐射外科治愈，并行C7-Th1节段肿瘤立体定向治愈；2014-2015年切除小脑血管母细胞瘤及C3-4节段病灶。2017年对6个小脑微型血管母细胞瘤（0.03-0.6 cm³）行辐射外科治愈，2018 年处理Th7及Th11节段肿瘤。2017 年因右肾 4×2.5×2.7 cm肾透明细胞癌行右肾部分切除术。2020 年起出现新发颅内病灶，颈椎肿瘤进展（胸椎及腰骶椎血管母细胞瘤无赫然变化）。2021 年选定射波刀对左小脑半球 5 个血管母细胞瘤行辐射外科治愈，后处理C5-Th1节段病灶。2022 年出现下肢进行性无力及严重难过详细征，影像学发现Th9节段髓内血管母细胞瘤伴脊髓出血，遂在神经电生理监测下行显微手术切除（病表面说：脊髓血管母细胞瘤，1 级），术后经受康复治愈。2024 年头以来，患者核心神经系统血管母细胞瘤出现进展性蜕变，拟研讨系统性靶向治愈。
讨论损失
通例检测未发现VHL基因变异
本文患者皆备合适VHLS诊断范例：12 岁起即出现多发性核心神经系统血管母细胞瘤，曾经受视网膜肿瘤切除术，并于 32 岁时行透明细胞肾癌（CCRC）切除术。可是，此前在另一践诺室进行的初度血液VHL突变分子遗传学检测未发现基因极度。研讨到该测序及变异注视为 14 年前完成，且原践诺室使用的是自行联想的MLPA探针，讨论东说念主员再行开展了VHL胚系突变筛查。通过Sanger测序分析VHL编码区及附进剪接位点，并选定MRC Holland探针的MLPA本事筛查大片断缺失，损失仍未能从患者血液DNA中检出VHL基因的致病性/可能致病性变异或临床好奇景仰好奇景仰好奇景仰好奇景仰未明变异（VUS）。
肿瘤样本的VHL突变分析
诊断第二步是对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤样本进行突变筛查。讨论东说念主员得回两份样本：2017 年CCRC组织及 2024 年血管母细胞瘤组织。通过Sanger测序，在两个肿瘤组织DNA中均检测到VHL基因3番外显子c.481C>T（p.Arg161Ter）变异，其突变等位基因峰明晰可见，但变异/正常等位基因比例存在差异（图1）。根据好意思国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南，该置换被归类为致病性变异，且既往已在VHLS患者中报说念。由于归并体系突变在间隔 7 年、不同器官着手且组织学类型差异的原发肿瘤中同期出现的可能性极低，故推测患者可能为嵌合型VHLS。可是，从表面上仍不可皆备摒除这些突变的体细胞发源，需通过血液DNA考证体细胞嵌合舒畅以确诊先天性疾病。
▲图1 患者不同原发性肿瘤中的c.481C>T (p.Arg161Ter)变异
血液样本VHL基因3番外显子斯文度NGS测序
为检测嵌合型变异，讨论东说念主员使用先前经Sanger测序未检出VHL胚系突变的血液DNA样本。扩增文库并特异性合成引物用于测序包含VHL:NM_000551.4:c.481C>T位点的区域。使用NGS进行靶向测序，见地位点阴私深度达 261，029X（图2），足以检测嵌合舒畅。损失骄傲，4868 条读长检测到T变异等位基因，正向/反向读长比例为 0.99（2，425/2，443）；该位点的其他变异等位基因（A和G）占比均低于 0.05%，其中一种变异的正向/反向读长存在 8 倍差异，可判定为测序诞妄（sequencing artifacts）而过滤。突变型T等位基因比例确定为 2%，这一损失从分子水平证实了该患者为嵌合型VHLS，突变品貌低。根据AMP/ASCO/CAP（好意思国分子病理学会/好意思国临床肿瘤学会/好意思国病理学家协会）指南，c.481C>T（p.Arg161Ter）突变的瞻望好奇景仰好奇景仰好奇景仰好奇景仰品级为IA级；鉴于该变异为疾病致病原因，对于多发/转换性肿瘤患者，FDA已批准贝组替凡（belzutifan）靶向治愈，并得回NCCN（好意思国国度详细癌症网罗）指南保举。需相配指出的是，讨论东说念主员已在针对该患者靶向治愈采用的多学科诊断召开前完成VHLS嵌合型的践诺室说明及诊断论说，此前因缺少VHLS分子遗传学确诊字据，贝组替凡治愈建议曾被暂缓扩充。
▲图2 嵌合变异的IGV图
讨 论
嵌合型VHL详细征的识别对于实时启动监测与遗传商量至关贫苦，早在 21 世纪初就已得到关怀。举例，讨论者曾报说念两个家系：子代患者均出现血管母细胞瘤、透明细胞肾癌（CCRC）和/或胰腺囊肿，并佩带VHL基因胚系突变，但选定沟通方法检测父母外周血均未检出该突变。在第一个家系中，先证者母亲患有血管母细胞瘤、胰腺及肾囊肿；第二个家系中，先证者父亲除上述三种VHLS发扬外，还罹患CCRC。通过荧光原位杂交（FISH）对白细胞DNA的深远讨论，在第一个家系母亲中检出VHL基因缺失；通过极度凝胶条带的Sanger测序，在第二个家系父亲中发现与子代突变一致的 3 bp VHL缺失。这一损失成效差别了遗传性VHLS与新发突变病例。讨论还标明，嵌合型VHLS的临床发扬严重进程不亚于经典遗传型。另有一例女性患者，11 岁和 18 岁时候别经受肾上腺嗜铬细胞瘤切除术，其父亲因VHL体系嵌合舒畅出现肾囊肿及附睾囊腺瘤。通例PCR及Sanger测序未能在其父亲血液中检出VHL突变，讨论者选定高效液相色谱本事成效识别含突变的PCR家具。
后续讨论报说念了一例高品貌但初度VHL检测漏诊的病例。该患者 66 岁因双侧CCRC进展物化，并伴多囊肾及胰腺病变。其女在 18 岁和 36 岁时经受血管母细胞瘤切除术并检出c.194C>G（p.Ser65Trp）突变，由此怀疑患者存在嵌合舒畅。通过PCR-RFLP本事相比凝胶电泳中突变条带与正常条带染色强度，狡计其血液基因组DNA中突变等位基因占比达 19%。2000-2010 年间，讨论者选定多种校正方法检测混有大批野生型等位基因的VHL突变，但缺少长入范例。由于毛细管遗传分析仪基础斥地及色谱分析软件的甩掉，Sanger测序对突变等位基因占比低于 10% 的异质性样本检测奢睿度不及。
跟着二代测序（NGS）本事的临床诓骗，可检测样本中低至数个百分点的突变等位基因。既往讨论骄傲，约 5% 具有典型VHLS症状的患者未检出VHL胚系突变，教唆可能为嵌合型。基于NGS本事的讨论证实，VHLS中体细胞嵌合占比达 8.5%。现在多基因NGS panel检测已成为通例检测（致使突出Sanger测序），其计策包括：当患者不同肿瘤中检出沟通突变时，对血液DNA原始测序数据再行分析；或针对见地区域进行高阴私深度二次NGS检测——恰是通事后者，本案牍例成效识别出血液中突变等位基因占比 2% 的VHL嵌合型。类似案例可见于 11 岁起反复发生血管母细胞瘤的患者：两次血液VHL胚系突变筛查均阴性，最终通过多肿瘤NGS组合检测确诊嵌合型VHLS。其他NGS成效案例包括：两名患者突变等位基因占比分别为 1.7% 和 5.7%（测序深度分别为 4059× 和 8902×），临床发扬为双侧CCRC和/或早发（16 岁起）核心神经系统血管母细胞瘤等严重VHLS表型。因此，即使第三方践诺室检测未发现VHL胚系突变，仍需在病历中注明"刻下查验阶段不可摒除嵌合型可能"（表1）。举例，一例 38 岁男性患者确诊小脑及脊髓血管母细胞瘤、CCRC及胰腺多囊病变，两次范例经过多基因NGS panel检测均未检出VHL突变，但讨论者仍合理建议通过FFPE样分内析摒除嵌合型。
▲表1 通例VHLS检测中由于嵌合舒畅导致的假阴性损失
要是患者具有VHLS的临床特征，但通例检测中的测序和MLPA未发现任何致病或可能致病的VHL变异，则不错通过以下形势络续诊断（图3）：
▲图3 含有嵌合评估的VHLS诊断算法经过
对肿瘤组织进行VHL检测，随后再行分析血液DNA测序数据或选定高阴私深度NGS对突变位点进行二次检测，以识别嵌合型VHLS。需与具有近似表型的其他癌症详细征进行辩认诊断，举例：①VHLS 2C型需与多发性内分泌腺瘤病2A型（MEN2A）及遗传性嗜铬细胞瘤/副神经节瘤详细征辩认；②疑似VHLS的遗传性CCRC需与BAP1肿瘤详细征及遗传性均衡易位t(3;8)差别。通过家系共分离分析和/或功能践诺考证临床好奇景仰好奇景仰好奇景仰好奇景仰未明变异（VUS），尤其针对潜在剪接位点突变。选定更高通量的本事（如全基因组测序/WGS），可能获知足外发现。举例：①某患者20岁起反复发生CNS血管母细胞瘤及多灶性CCRC，无VHLS家眷史，胚系点突变及VHL大片断缺失检测均阴性。WGS发现其佩带新发均衡易位t(1;3)(p36.3;p25)，断裂点位于VHL基因2号内含子区域，可视为等位基因失活事件，从而确诊VHLS；②另一无VHLS家眷史患者，37 岁起经受视网膜血管瘤、CNS血管母细胞瘤及多灶性CCRC治愈，Sanger测序及MLPA均未检出VHL胚系突变。家系WGS三重测序骄傲该患者佩带ELOC基因新发胚系杂合变异c.236A>G（p.Tyr79Cys）。ELOC编码延迟卵白C（elongin C）——pVHL在缺氧指挥因子（HIF）降解复合体中的主要结合伴侣。作家进一步诠释，该变异在功能层面导致与VHL失活突变类似的损失。值得珍爱的是，根据2022年WHO肾肿瘤新分类，沟通体系变异是界定“ELOC突变相关型肾癌”的最常见突变。这教唆ELOC可能成为VHLS的第二候选基因。
相比Sanger测序与NGS检测嵌合型变异的奢睿度较为复杂，因其受多种身分影响。Sanger测序损失受以下身分制约：毛细管测序仪设施对截断线的基础斥地、标记片断的信号强度、因双脱氧隔断子未有用吊销或非特异性PCR家具产生的次要信号杂音，以及践诺室遗传学家分析色谱图的警告。而NGS检测奢睿度则取决于见地突变位点的测序深度、最小等位基因频率（MAF）、践诺室分析经过，以及患者表型数据对变异注视的解救进程。总体而言，VHL等位基因中嵌合型变异比例低于 10% 时，更易出现假阴性损失。其他遗传性癌症详细征的嵌合型病例相通骄傲，0-10% 的突变品貌属于临界范围，需通过斯文度NGS/数字PCR进行考证。举例，一例结直肠癌及子宫内膜样癌合并嵌合型林奇详细征患者，其正常结肠组织中MSH6致病性突变品貌为 5.34%，血液DNA中仅 1.64%。结节性硬化症患者讨论亦标明，传统方法检测血液样本中变异等位频率的临界值为 10%，此类低水平嵌合患者的平均突变等位基因比例为 6.8%。
明确VHLS诊断对制定手术计策至关贫苦。与闲适性CCRC（确诊后即切除）不同，VHLS患者因常发生双侧和/或多灶性CCRC，需尽可能保留功能性肾本色。因此选定"3 cm原则"：当肿瘤最大径达 2.5-3 cm且未骚扰肾包膜、肾盏/肾盂或大血管时，行小范围切除术。
识别VHLS嵌合型病例的另一贫苦好奇景仰好奇景仰好奇景仰好奇景仰在于可使用贝组替凡（belzutifan）——一种采用性HIF2α抑遏剂进行治愈。细胞内HIF浓度升高是功能性pVHL缺失的损失，亦然VHLS相关肿瘤发生的主要致病机制。贝组替但凡FDA批准用于确诊VHLS患者中无需即刻手术的CCRC、血管母细胞瘤及胰腺神经内分泌肿瘤的全身治愈药物。对于某些病例（如多发性进展性血管母细胞瘤患者），该药物可能是独一合理的靶向治愈有缱绻，因其他激酶抑遏剂疗效有限。结合突变类型过甚在个体患者中的预期功能效应，狡计机药物联想及东说念主工智能器用（如AlphaFold）有望为将来VHLS的个体化靶向治愈提供瞻望与斥地解救。
经分子遗传学方法确诊的VHLS，可使患者按照专科医学协会保举的主动监测有缱绻进行早期肿瘤筛查。根据2017年指南，初度专项查验建议始于婴幼儿期。现在遍及选定2020年VHL定约制定的监测有缱绻，其年度查验相貌包括：①1岁起：全身查体及散瞳眼底查验（视网膜血管瘤）；②2 岁起：血压及脉搏监测；③5 岁起：加多间甲肾上腺素类物资检测（嗜铬细胞瘤）；④11 岁起：每2年一次增强/平扫脑部和脊柱MRI、听力测试（血管母细胞瘤）；⑤15 岁起：每 2 年一次内耳说念MRI（单次）、腹部MRI（透明细胞肾癌、嗜铬细胞瘤、肾/胰腺病变）。65 岁后隔断部分专项监测。若发现血管母细胞瘤体积增大或跟随症状，应每年（或更常常）进行影像学查验，必要时转诊神经外科。对于 <3 cm的肾肿瘤，每 3-6 个月行MRI复查以评估领路性；连气儿三次领路后可延长至每 2 年一次。若肾肿瘤 >3 cm，建议转诊至熟识VHLS处治的泌尿外科。
最新指南对筛查肇端年岁略有调遣：2022 年丹麦讨论团队建议 10 岁起启动CNS MRI筛查血管母细胞瘤；2024 年德国讨论则提倡 12 岁驱动CNS MRI更具合感性。这些数据突显了VHL突变坚忍对制定个体化监测计策、治愈采用及手术决策的贫苦指挥好奇景仰好奇景仰好奇景仰好奇景仰。
结 论
讨论东说念主员示意需要强调以下几点：①既往可能低估VHLS过甚嵌合型的发病率；②嵌合型与VHL突变“经典”杂合子的临床发扬严重进程及发病年岁无显贵差异；③实时诊断VHLS（包括嵌合型）对突变佩带者监测、手术计策制定及贝组替凡靶向治愈至关贫苦；④通过血液DNA分析（尤其是迎阿患者FFPE肿瘤样本）结合NGS本事可有用识别嵌合型VHLS。综上，实时检出突变并明确诊断会平直影响VHLS患者的主动监测有缱绻、手术采用及靶向治愈决策。
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参考文件：
Mikhaylenko， D.S.; Kuryakova， N.B.; Efremova， A.V.; Volodinindian sex5， I.V.; Kutsev， S.I.; Zaletaev， D.V.; Strelnikov， V.V. Mosaic Form of von Hippel–Lindau Syndrome: Case Report and Literature Review. Int. J. Mol. Sci. 2025， 26， 2751. https://doi.org/10.3390/ijms26062751
发布于：江苏省